luciferase（做luciferase需要注意些什么）
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做luciferase需要注意些什么
为取得最佳测定效果，在用单管的荧光测定仪测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内，例如30秒内。由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。为保证荧光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。一般来说，如果不分装使用三次(期间冻融三次)，对测定结果无明显影响。样品和测定试剂混合后，必须等待1-2秒，再进行测定。测定时间通常为10秒，根据情况也可以测定更长或更短时间，但是同一批样品最好使用相同的测定时间。为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差，可以同时转入Renilla荧光素酶的报告基因质粒作为内参，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测;也可以同时转入β-半乳糖甘酶报告基因质粒作为内参，然后采用β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒进行检测。采用荧光素酶报告基因检测试剂盒中的报告基因细胞裂解液裂解获得的样品，可以直接用于β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒中的测定。影响荧光酶活性的因素很多，温度，PH值，培养基里的酚红含量，注意荧光素必须要避光保存，否则发光减弱。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作
哪位同学可以介绍下Luciferase 原理
自然界中广泛分布着生物发光有机体,其中包括细菌、真菌、鱼、昆虫等.在这些生物发光有机体中催化生物发光反应的各种酶都称之为荧光素酶（Luciferases）,底物则命名为荧光素（Luciferin）.自1986— 1987 年首次被当作报告基因使用以来,荧光素酶基因已成为目前运用最广泛的报告基因之一.尽管来自不同物种的荧光素酶及底物存在有很大的差异,但有一个共同点,即在生物发光反应体系中均需发生氧化反应.它通过两个步骤使底物荧光素发生氧化作用,而产生发光反应,此反应是ATP 依赖性的.杂环荧光素首先腺苷化,然后通过氧化脱羧作用,产生AMP、CO2,并通过激活的荧光素中间产物发射光.将反应所需的试剂与含有荧光素酶的细胞裂解液混合即会产生一种迅速衰减（在一秒钟内）的黄绿色闪光（发射峰560 nm）,这种光信号可用配备了便于迅速混合反应物的自动注射装置的荧光检测仪（Luminometer）进行检测,也可用标准的液闪仪对光信号进行记录.当底物过量时,发光量的总值与样品的荧光酶活性成正比,因此,可对荧光素酶报告基因的转录进行间接估计.荧光素酶易被蛋白酶降解,在转染的哺乳动物细胞中的半衰期约为3 小时.荧光素酶报告系统为启动子活性的检测提供了一个敏感、快速、非放射性的检测方法.荧光素酶报告基因检测试剂盒(Luciferase Reporter Gene Assay Kit),是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase).荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence).然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光.通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达.通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在luciferase的上游或其他适当的地方,构建成报告基因质粒.然后转染细胞,适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性.通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响.
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